BIM Biotechnologie en industriële microbiologie

by
451 Flashcards en notities
3 Studenten

Studeer slimmer met eFaqt samenvattingen

  • Beschikbaar voor computer, tablet, telefoon en op papier
  • Vragen met antwoorden over de leerstof
  • Ongelimiteerde toegang tot 300.000 online samenvattingen
  • Tools voor slim studeren & timers voor betere resultaten

Bekijk deze samenvatting

PREMIUM samenvattingen zijn gecontroleerd op kwaliteit en speciaal geselecteerd om je leerdoelen nog sneller te kunnen bereiken!

Samenvatting - BIM Biotechnologie en industriële microbiologie

  • 2 Mutagenese

  • wat zijn de eigenschappen van screening bij random mutagenese?
    veel werk/weinig kans op succes
  • Wat zijn de eigenschappen van gerichte mutagenese?
    minder mutanten, grotere kans op succes
  • Chemische modificatie (gerichte mutagenese) is wel/niet specifiek?
    niet specifiek
  • Wat is een andere benaming voor de de recht-toe-recht-aan-methode?
    Oligo-gestuurde mutagenese met M13-vectoren
  • Hoe wordt de gewenste mutatie genoemd? 
    mismatch
  • Transformatie bij PCR-oligo gestuurde mutagenese: alleen --- moleculen worden plasmiden
    circulaire
  • Voordeel PCR-oligo gestuurde mutagenese?
    snelle verrijking, geen omkloning
  • M13 = enkelstrengs of dubbelstrengs DNA?
    beide
  • Hoe wordt het proces van het genereren van aminozuren die coderen voor veranderingen op DNA niveau genoemd?
    gerichte mutagenese
  • Welke structuur moet bekend zijn om het bepalen welke aminozuur van een eiwit verandert moet worden om een specifiek eiwit te verkrijgen makkelijker te maken?
    de driedimensionale structuur
  • Vaak geen 3D structuur bekend, dus gerichte mutagenese bestaat dan uit trial-and-eror strategie, waarna het eiwit word gecontroleerd
  • Oligonucleotide-gerichte mutagenese  =
    site-specifiek mutagenese voor het produceren van gedefinieerde puntmutaties in een gekloond gen
  • Voor oligonucleotide gestuurde mutagenese moet de onderzoeker de volgende 2 dingen weten:
    1. de precieze nucleotidesequentie die codeert voor de mRNA die verandert moet worden
    2. de aminozuur veranderingen die worden geïntroduceerd.
  • Een methode van M13 oligonucleotide-gestuurde mutagenese :
    Het gekloneerd gen wordt geplaatst in een dubbelstrengse vorm van een M13 bacteriofaag vector--> Enkelstrengse vorm van de recombinante vector wordt geïsoleerd en gemixed met een synthetische oligonucleotide--> De oligonucleotide heeft, op één nucleotide na, een sequentie die excact complementair is aan een deel van eht gekloonde gen--> De mismatch valt precies samem met het nucleotide van het mRNA codon die getarget is voor verandering.
  • Wat is de grootste nadeel van bacteriofaag M13 oligonucleotide-gestuurde mutagenese?
    De tijdrovende stappen voordat de gemuteerde vorm van target gen uiteindelijk geïsoleerd is.
  • Voordeel van oligonucleotide-gestuurde mutagenese met plasmide DNA t.o.v. oligonucleotide-gestuurde mutagenese met M13 DNA?
    Niet meer nodig om een target te subklonen van een plasmide in een M13 en dan, na mutagenese, terug te kloneren in een plasmide.
  • In een van plasmide mutagenese protocollen wordt de target DNA in een MCS (multiple cloning site) op een plasmide vector ingevoerd die een functionele Tet'r en een niet-functionele Amp'r gen bevat als gevolg van een enkele nucleotide vervanging in het midden van de Amp'r gen.->Om de hoev. DNA te doen toenemen, wordt de vector (die target DNA draagt) getransformeerd in E.coli gastheercellen.--> groei van getransformeerde cellen gevolgd-->dubbelstrengs plasmide DNA onttrokken -> en dan gedenatureerd, zodat enkelstrengs circulaire DNA moleculen gevormd worden. --> 3 verschillende oligonuclotiden die annealen aan een van de enkelstrengse circulaire DNA moleculen worden toegevoegd aan monster van gedenatureerd plasmide DNA:
    -een oligonucleotide speciaal ontworpen om target DNA aan te veranderen
    -een oligonucleotide ontworpen om de vervangen nucleotide in de niet-functionele Amp'r gen te corrigeren
    -ontworpen om een enkele nucleotide in de Tet'r gen te veranderen zodat --> niet-functioneel
    --> De 4 deoxyribonucleoside trifosfaat + T4 DNA polymerase (die zelfde activiteit heeft als Klenow fragment van E.coli DNA polymerase I) toegevoegd aan reactie mix en de 3'uiteinden van de annealde oligonucleotiden treden op als primers voor DNA synthese met het intacte circulaire DNA molecuul als template. --> Nadat synthese en ligase klaar-->reactiemix gebruikt voor transformatie E.coli cellen. -->Transformanten geselecteerd voor Ampicilline resistentie en tetracycline gevoeligheid. -->
    Met deze procedure heeft ~90% van geselecteerde transformanten de gespecificeerde mutatie in target gen.
    In overige 10% target gen is onveranderd, omdat de oligonucleotide niet anneald heeft met target gen of omzeild was tijdens DNA synthese.
    De cellen met de gespecificeerde mutatie in target gen worden geïdentifiseerd d.m.v. DNA hybridisatie.

  • Hoeveel procent van de geselecteerde transformanten hebben de gespecificeerde mutatie in het target gen m.b.v. oligonucleotide-gestuurde mutagenese?
    90%
  • In een van de PCR-oligo-gestuurde mutagenes protocollen wordt het target gen gekloneerd in een plasmide vector.  --> Een monster van deze plasmide wordt gesplitst in 2 gelijke delen-->2 specifieke PCR oligonucleotiden primers worden toegevoegd aan elke buis :
    - een primer is volledig complementair aan een sequentie binnen/aangrenzend aan het gekloneerde gen
    - een primer complementair aan ander deel van gekloneerd gen, op een gen na, welke getarget is voor verandering
    In beide buizen annealen de primers met de 1nucleotide mismatch aan de tegeovergestelde streng -> zo worden beide nucleotiden van een specifieke base paar getarget. De 2e primer paar, in beide buizen, is volledig complementair aan een korte DNA segment. De plek van de gehybridiseerde regio's van de primers in de 2 reacties zijn zodanig dat na PCR cycling de geamplificeerde DNA moleculen verschillende uiteinden hebben. -->Na PCR worden de inhouden van beide reacties gemixed, gedenatureerd en gerenatureerd. --> A.g.v. de verschillende plekken van de uiteinden van het geamplificeerde DNA in de 2 ootspronkelijke buizen hybridiseert een streng van een buis met zn complementaire streng van de andere buis om zo -> circulaire DNA moleculen met 2 'offset nicks'.  Deze 'nicks' worden in vivo gerepareerdnadat ze geïntroduceerd zijn door transformatie in E.coli. Wanneer 2 complementaire strengen van dezelde buis met elkaar gaan hybridiseren, onstaan lineaire DNA moleculen. Alleen de circulaire soorten worden stabiel gehouden en doorgegeven in E.coli.
  • PCR-oligo-gestuurde mutagenese: Wat onstaat er wanneer 2 complementaire strengen van dezelfde reactiebuis met elkaar gaan hybridiseren
    lineaire DNA moleculen
  • Welke vorm van DNA moleculen worden stabiel gehouden en doorgegeven in E.coli?
    circulaire DNA moleculen
  • Voordelen PCR-oligo-gestuurde mutagenese?
    Gekloneerd gen hoeft niet in M13, geen verrijkende procedures nodig (zoals dut en ung systeem) en het gemuteerde gen hoeft ook niet gesubkloneerd van M13 in een expressie plasmide vector.  
  • Wat kan alfa-amylase ook doen?
    breekt zetmeel af in glucose-eenheden -> glucose fermiteren tot alcohol
    • HC 2 HOORcollege
    • sterke promotor ervoor-> sterkere expressie
    • At-random kan vb. door bestralen; dna beschadigen->dna gerepareerd op misschien andere manier (kijken wat voor mutant onstaat-> misschien betere eiwit dan die je had)
    • Soorten mutaties: deletie, puntutaties, insertie, invertie (puntmutatie)
    • Insertie: niet geschikt! 1 nucleotide invoeren-> hele leesraam verandert ->ander eiwit (deletie ook niet goed)
    • Puntmutatie wel nuttig want dan vervang je nucleotide ; ene a.zuur in andere vervangen, leesraam zelfde
    • elk aminozuur kan door 19 andere vervangen worden -> x^20
    • Km : maat voor affiniteit van enzym voor substraat. hoe klener km, hoe groter affiniteit (enzym kan dan bij lagere substraatconc. werken)
    • allosterische eigenschpppen heeft met kinetiek van eiwit te maken.
    • Met M13 ene nucleotide in andere veranderen.
    • M13 is bacterievirus
    • In oligo zit mutatie die je graag in gekloneerd gen wilt hebben
    • M13: enkelstrens circulair DNA. replicative form = dubbelstrengs
    • Als je e.coli ermee infecteerd-> weer enkelstrengs
    • klenow-enzym-gemodificeerd-e.coli-37 C- kan verlengen, laatste base controleren
    • Ligase om te dichten -> daarna WTe.coli transformeren->M13 plaques
    • WT is DUT en UNG+ -> DNA afgebroken -> streng met mutatie overgehouden
    • DUT- en UNG- --> veel Utjes aanwezig
    • Neiuwe streng bevat geen Utjes, wel mutatie--> nieuwe vermedigvuldigt, oude niet
    • ssDNA met Utjes isoleren + oligo met mismatch erbij--> transformeer in WTE (zit UNG+ in)-> verwijdert U uit oude strengen, nieuwe (mutanten streng) heel.
    • Als U eruit-> DNA niet levensvatbaar.

    • Bij MCS kun je gen kloneren (heeft knipplaatstsen)
    • AMP's (groeit niet op -ampicicline plaat) -> daarin mutatie-> weer AMP'r
    • In bac komen ook ligasen voor
  • vb. M13 oligo-gestuurde mutagenese: de sequentie ATT wordt verandert in CTT. De oligonucleotide hybridiseert naar het complementaire deel van het gekloonde gen, wanneer
    1. deze in overmaat t.o.v. het M13 DNA wordt toegevoegd
    2. wanneer de mismatch in de buurt van het midden van de oligonucleotide is
    3. wanneer het mixen gebeurt bij een lange temperatuur en met een hoge concentratie zout.

    Het 3' uiteinde van het gehybridiseerde oligonucleotide treedt op als een primer site voor het begin van DNAsynthese die de intacte M13 streng gebruikt als template. De replicatie, welke gebruikt maakt van de 4 deoxyribonucleotide trifosfaat, wordt gekatalyseerd door het Klenow fragment van E.coli DNA polymerase I. Er wordt T4 DNA ligase toegevoegd om er zeker van te zijn dat de laatste nucleotide van de gesynthetiseerde streng aansluit bij de 5' uiteinde van de primer. Omdat in vitro DNA synthese vaak incompleet is, moeten deels dubbelstrengse M13 moleculen verwijdert worden van de mix d.m.v. sucrose gradiënt centrifugatie.
    Elke complete dubbelstrengse M13 molecuul, die nu de mismatch bevat, wordt geïntroduceerd in E.coli cellen door transformatie. Geïnfecteerde cellen produceren M13 virusdeeltjes, welke uiteindelijk de cellen lyseren en plaques vormen.Theoretiech, omdat plasmide DNA semi-conservatief word gerepliceerd, bevat de helft van de fagen die worden gevormd de wild-type sequentie en de andere helft bevat de gemuteerde sequentie met de specifieke nucleotide verandering. Fagen die geproduceerd zijn in de begin transformatie stappen, worden gepropageerd un E.coli, en delen dei alleen het gemuteerd gen bevatten, worden geïdentificeerd door DNA hybridisatie. Hierbij is de orriginele oligonucleotide de probe. Nadat de dubbelstrengse vorm van M13 geïsoleerd is, word de gemuteerde gen weggesneden door digestie met restrictie enzymen en wordt dan gesplitst naar een E.coli plasmide vector. Voor verder onderzoek wordt het aangepaste eiwit ge-expresseerd in en gezuiverd van de E.coli cellen. Echter, in realiteit bevat niet 50%, maar 1-5% (door technische redenen) van de plaques werkelijk de fagen met het gemuteerde gen.  Daarom is methode op vele manieren aangepast. vb E.coli met 2 defecte DNA metabolisme genen: een defectieve vorm van dUTPase (dut)(zonder dut, veel dUTP intracellulair) en een defectieve uracil N-glycosylase (ung) (zonder ung, dUTP niet verwijdert).-->De enkelstrengse M13 DNA door deze E.coli vervangt ~1% van zn T's door U's. Een mismatchede oligonucleotide primer wordt gehybridiseerd naar deze vervangende M13 DNA, en de 2e streng van M13 wordt gemaakt d.m.v. in vitro synthese en ligatie. De dubbelstrengse bacteriofaag wordt vervolgens geïntroduceerd in een E.coli stam die de functionele ung gen bevat. De actieve ung in de gastheercel verwijdert dan de U resten uit de trasnsformerende M13 DNA. Gevolg: orriginele M13 template streng wordt afgebroken en alleen de gemuteerde streng (zonder dUTP) word gerepliceerd. Zo is yield van M13 bacteriofaag met een gen met site-specifieke mutatie significant toegenomen.
Lees volledige samenvatting
Maak nu je eigen eFaqt account aan voor toegang tot deze en duizenden andere hoge kwaliteit samenvattingen.

Voorbeelden van vragen in deze samenvatting

wat zijn de eigenschappen van screening bij random mutagenese?
1
Wat zijn de eigenschappen van gerichte mutagenese?
1
Chemische modificatie (gerichte mutagenese) is wel/niet specifiek?
1
Wat is een andere benaming voor de de recht-toe-recht-aan-methode?
1
Pagina 1 van 90